转基因植物T-DNA的组织结构是农杆菌T- DNA序列整合到植物基因组的终产物，其中T-DNA拷贝数以及T-DNA整合导致的DNA重排和基因组序列变化都会影响转基因表达水平和表达的稳定性(Jones et al., 1987; Jorgensen et al., 1987)。因此，研究转基因植物T-DNA的组织结构具有重要意义。

T-DNA共转化是获得无选择标记转基因植物的重要途径之一(Ebinuma et al., 2001; 李桂民等, 2004; 吴顺等, 2008)。Komari等(1996)将潮霉素磷酸转移酶(HPT)和β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)共转化水稻和烟草，HPT T-DNA和GUS T-DNA在大约50%的转基因系中表现独立遗传。此外，在一定比例的共转化植株中，有不同类型的T-DNA整合到相同遗传位点，所以共转化还被应用于转化多个功能基因和实现转基因聚合(Halpin, 2005)。

De Neve等(1997)对HPT和新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)的共转化拟南芥植株进行遗传和Southern杂交分析，结果表明，44.4%的共转化植株含有T-DNA共整合结构，包括两种T-DNA形成的串联结构和一种T-DNA形成的多拷贝结构。De Buck等(1999)研究了共转化拟南芥植株由K T-DNA和Hsb T-DNA连接形成的9个串联T-DNA结构，发现T-DNA之间的连接过程可能类似于T-DNA与植物基因组DNA之间的重组过程，并且T-DNA之间通过右边界(RB)进行连接的序列变化比较精确，RB保持完整或只缺失少数碱基，然而通过左边界(LB)连接则发生LB和LB内侧序列的缺失以及精确性较低的DNA修复，例如填充DNA (filler DNA)的插入。Afolabi等(2004)利用BAR基因和HPT基因的T- DNA载体进行水稻共转化，56%的共转化植株含有共整合的BAR T-DNA和HPT T-DNA，T-DNA序列发生部分缺失的植株频率为70%~78%。

关于共转化植株T-DNA的共整合结构，包括由不同T-DNA组成的串联结构以及相同T-DNA组成的多拷贝结构，已经在拟南芥等双子叶植物中进行了深入研究(De Neve et al., 1997; De Buck et al., 1999)。但是水稻等单子叶植物的相关研究仅局限于共转化植物的遗传和Southern杂交分析(Komari et al., 1996; Afolabi et al., 2004; 吴顺等, 2008)，尚未对共整合T-DNA的序列变化进行系统研究。本研究将分别含有红色荧光蛋白(mCherry)、绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的3种T-DNA载体共转化水稻愈伤组织细胞，利用荧光标记筛选共转化个体，对共整合T-DNA的结构模式和碱基变异进行PCR检测和序列分析，从而为解析水稻T-DNA共整合的分子机理奠定研究基础。

1结果与分析
1.1共转化水稻植株的获得
为研究共转化水稻植株T-DNA的共整合结构，包括由不同T-DNA组成的串联结构以及相同T-DNA组成的多拷贝结构，本研究构建了红色荧光蛋白(mCherry)载体pLYL04和绿色荧光蛋白(GFP)载体pLYL07 (图1)，将分别携带pLYL04、pLYL07以及潮霉素磷酸转移酶(HPT)载体pCAMBIA1301 (图1)的农杆菌按照1:1:1比例混合，然后转化日本晴水稻愈伤组织。与混合菌液共培养的297个水稻愈伤，经过两轮约40 d的潮霉素抗性选择培养，产生169个独立转化的抗潮霉素愈伤。在BLS灯式荧光检测器下观察培养基上的抗性愈伤，筛选独立转化的mCherry⁺GFP⁺双荧光愈伤、mCherry^-GFP⁺以及mCherry⁺GFP^-单荧光愈伤，再经过分化和生根培养，分别获得了3个mCherry⁺GFP⁺、13个mCherry^-GFP⁺和14个mCherry⁺GFP^-转基因水稻植株(T₀)。其中双荧光和单荧光植株的转化频率分别为1.78% (3/169)和15.98% (27/169)。此外，部分mCherry^-GFP^-抗性愈伤经过分化培养，产生了18个双阴性转化植株。

图1 转基因载体的T-DNA区 注: RB和LB: T-DNA右边界和左边界序列; P35S:花椰菜花叶病毒35S启动子; mCherry: mCherry红色荧光蛋白; Tnos: 胭脂碱合酶终止子; GFP: 绿色荧光蛋白; GUS: β-葡萄糖醛酸苷酶; HPT: 潮霉素磷酸转移酶; T35S: 花椰菜花叶病毒35S终止子; 箭头方向为PCR引物扩增方向 Figure 1 T-DNA regions of the transformation vectors Note: RB and LB: T-DNA right and left borders; P35S: CaMV 35S promoter; mCherry: mCherry fluorescent protein; Tnos: Nopaline synthase terminator; GFP: Green fluorescent protein; GUS: β-glucuronidase; HPT: Hygromycin phosphotransferase; T35S: CaMV 35S terminator; Arrows indicate the amplification directions of PCR primers

将转化植株的T₁代种子发芽，从每个株系得到14~30株幼苗，然后进行mCherry和GFP荧光检测。双荧光和单荧光植株在T₁代分别产生双荧光和单荧光分离个体，而双阴性植株在T₁代全部呈双阴性表型(部分T₁幼苗的检测结果见图2)。所以，T₁代幼苗的荧光检测结果与T₀植株的荧光表型相符合。

图2 双荧光, 单荧光和双阴性共转化水稻植株T1代分离个体的荧光检测 注: 共转化水稻植株的T1代分离个体分别在白光(A), 蓝光(B)和绿光(C)下拍摄的图片; 1705: T0双荧光植株1705的1个T1代幼苗(mCherry+GFP+); 1746: T0单荧光植株1746的1个T1代幼苗(mCherry-GFP+); 1725: T0单荧光植株1725的1个T1代幼苗(mCherry+GFP-); 1741: T0双阴性植株1741的1个T1代幼苗(mCherry-GFP-) Figure 2 Fluorescence detection of the T1 segregants of doublefluorescent, single-fluorescent and doublenegative co-transformed rice plants Note: Images of T1 segregants of rice co-transformants under white light (A), blue light (B), green light (C), respectively; 1705: A T1 seedling (mCherry+GFP+) segregated from the doublefluorescent transformant 1705; 1746: A T1 seedling (mCherry-GFP+) from the single-fluorescent transformant 1746; 1725: A T1 seedling (mCherry+GFP-) from the single-fluorescent transformant 1725; 1741: A T1 seedling (mCherry-GFP-) from the double-negative transformant 1741

1.2共转化植株T-DNA共整合结构的PCR检测
分别从3个双荧光、27个单荧光以及18个双阴性的T₀植株提取水稻DNA，用HPT、GUS、GFP和mCherry基因的特异引物进行PCR检测，所有水稻材料均能够扩增出pCAMBIA1301载体的HPT和GUS基因。但是8个(16.7%)植株的PCR检测结果与其荧光表型不一致：双阴性植株1753、1768、1772、1774、1784和1785仍然扩增出mCherry特异性条带，单荧光植株1755 (mCherry⁺GFP^-)和1773 (mCherry^-GFP⁺)同时扩增出mCherry和GFP条带。这可能因为共转化植株的某些T-DNA拷贝发生了序列缺失，或因为转基因沉默导致mCherry或GFP不能正常表达。

根据pLYL04、pLYL07和pCAMBIA1301的T- DNA序列，设计不同扩增方向的特异引物，采用15种引物组合对48个T₀代共转化植株进行PCR分析。通过其中4对引物，从17个(35.4%)共转化植株检测到两种T-DNA连接形成的串联结构(简称“串联结构”) (图3A)；通过3对引物，从24个(50%)共转化植株检测到相同T-DNA连接形成的多拷贝结构(简称“多拷贝结构”) (图3B)；其中11个植株同时含有串联及多拷贝结构。串联T-DNA的边界序列通过LRRL、RLLR或LRLR连接模式进行连接(表1; 表2; 表3)。在以上17个含有串联结构的植株中，13个植株具有1种连接模式，3个植株(1772, 1773和1775) (表1)具有2种模式，转化植株1755的共整合结构最为复杂，同时检测到3种连接模式。而24个多拷贝植株的T-DNA边界均表现为LRLR模式(模式5, 6和7) (表3)。

图3 共转化水稻植株串联及多拷贝T-DNA的PCR检测 注: M: Trans 2K plus marker; A: T0代共转化植株1705, 1751, 1753, 1755, 1772, 1773, 1776和1779中LRLR模式串联T-DNA (表3, 模式3, 引物组合LZL87+LZL90)的PCR检测; B: T0代共转化植株1703, 1704, 1707, 1709, 1725和1743中LRLR模式多拷贝T-DNA (表3, 模式6, 引物组合LZL88+LZL89)的PCR检测 Figure 3 PCR detection of tandem-linked and multi-copy T-DNAs in co-transformed rice plants Note: M: Trans 2K plus marker; A: PCR detection of the LRLR tandem-linked T-DNAs (table 3, pattern 3, primers LZL87 and LZL90) in T0 co-transformed plants 1705, 1751, 1753, 1755, 1772, 1773, 1776 and 1779; B: PCR detection of the LRLR multi-copy T-DNAs (table 3, pattern 6, primers LZL88 and LZL89) in T0 co-transformed plants 1703, 1704, 1707, 1709, 1725 and 1743

表1 共转化水稻植株LRRL模式共整合T-DNA连接区的DNA序列变异 Table 1 Nucleotide variation in the junctions of co-integrated T-DNAs with LRRL ligation pattern in co-transformed rice plants

表2 共转化水稻植株RLLR模式共整合T-DNA连接区的DNA序列变异 Table 2 Nucleotide variation in the junctions of co-integrated T-DNAs with RLLR ligation pattern in co-transformed rice plants

表3 共转化水稻植株LRLR模式共整合T-DNA连接区的DNA序列变异 Table 3 Nucleotide variation in the junctions of co-integrated T-DNAs with LRLR ligation pattern in co-transformed rice plants

1.3共转化植株T-DNA共整合结构的DNA序列分析
对共转化植株的PCR检测产物进行测序，获得了22个串联结构的T-DNA连接区序列信息(表1; 表2; 表3)。连接区的DNA序列变化表现如下：(1) pLYL04/pCAMBIA1301共转化产生的全部LRRL植株均缺失两个相邻RB边界(模式1) (表1; 图4A)；(2)在pLYL04/pCAMBIA1301共转化产生的RLLR串联植株中，50% (3/6)植株的相邻LB边界完全缺失，剩余植株的1个LB完全缺失，另1个LB含1~21 bp碱基变异(模式2) (表2)；(3)在pLYL04/pCAMBIA1301共转化和pLYL04/pLYL07共转化产生的LRLR串联植株中，37.5% (3/8)植株的相邻RB和LB边界完全缺失，剩余植株的RB完全缺失，LB则含1~16 bp碱基变异(模式3和模式4) (表3; 图4B)。因此，所有LRRL串联植株T-DNA连接区的DNA变异相似，即2个相邻RB边界完全缺失，而RLLR和LRLR串联植株因为LB的序列变化而表现不同变异类型。

图4 LRRL和LRLR串联T-DNA连接区的碱基变异 注: A: pLYL04 T-DNA和pCAMBIA1301 T-DNA按LRRL模式形成的连接区, 4个共转化植株(1749, 1750, 1761和1775)的相邻RB完全缺失, RB内侧序列缺失数目不等的碱基; B: pLYL04 T-DNA和pCAMBIA1301 T-DNA按LRLR模式形成的连接区, 4个共转化植株(1772, 1773, 1776和1779)的RB完全缺失, LB及LB内侧序列发生数目不等的碱基缺失; 星号标注的碱基代表边界及其内侧序列的碱基缺失 Figure 4 Nucleotide variations in the junctions of LRRL and LRLR tandem-linked T-DNAs Note: A: The junctions of LRRL tandem-linked pLYL04 T-DNA and pCAMBIA1301 T-DNA, in which four T0 co-transformed plants (1749, 1750, 1761 and 1775) showed deletion of all RB borders and various number of nucleotides in the RB inward sequences; B: The junctions of LRLR tandem-linked pLYL04 T-DNA and pCAMBIA1301 T-DNA, in which four T0 co-transformed plants (1772, 1773, 1776 and 1779) showed deletion of RB and various number of nucleotides in LB and LB inward sequences; The nucleotides marked with stars represent nucleotide deletions in the T-DNA borders and their inward sequences

本研究对共转化植株的25个LRLR多拷贝结构进行了序列分析(模式5, 模式6和模式7) (表3; 图5)。将LRLR连接模式的多拷贝结构和串联结构进行比较，在T-DNA连接区，分别有20% (5/25)和37.5%多拷贝和串联植株同时缺失相邻RB和LB，其它多拷贝和串联植株都发生RB完全缺失，LB缺失不同数目的碱基或其3’末端的1个C碱基发生C→T颠换。因此，这两类LRLR结构的碱基变化具有部分相似性。

图5 LRLR多拷贝T-DNA连接区的碱基变异 注: A: 2个pLYL04 T-DNA拷贝形成的连接区, 5个共转化植株(1755, 1772, 1773, 1784, 1785和1788)的LB和RB边界及其内侧序列具有完全一致的碱基变异; B: 2个pLYL07 T-DNA拷贝形成的连接区, 3个共转化植株(1703, 1707和1709)的碱基变异完全一致; C: 2个pCAMBIA1301 T-DNA拷贝形成的连接区, 4个共转化植株(1730, 1741, 1755和1774)表现完全一致的碱基变异; 星号标注的碱基代表边界及其内侧序列的碱基缺失或颠换 Figure 5 Nucleotide variations in the junctions of LRLR multi-copy T-DNAs Note: A: The junctions between two pLYL04 T-DNAs, in which five T0 co-transformed plants (1755, 1772, 1773, 1784, 1785 and 1788) showed identical nucleotide variations in the LB, RB, and their inward sequences; B: The junctions between two pLYL07 T-DNAs, in which three T0 co-transformed plants (1703, 1707 and 1709) showed identical nucleotide variations; C: The junctions between two pCAMBIA1301 T-DNAs, in which four T0 co-transformed plants (1730, 1741, 1755 and 1774) showed the same variations; The nucleotides marked with stars represent nucleotide deletions or transversions in the T-DNA borders and their inward sequences

此外，在22个串联结构和25个多拷贝结构的T-DNA连接区，RB或LB边界的完全缺失还伴随其内侧一定数目的碱基缺失(表1; 表2; 表3)，其中边界及边界内侧形成大片段缺失(247~643 bp)的频率分别为13.6% (3/22)和12% (3/25)。

2讨论
分析共转化水稻中22个由两类T-DNA形成的串联结构，结果发现T-DNA连接区LB和RB序列的变化与拟南芥中的相关研究结果不完全相同。首先，共转化水稻由RB参与的T-DNA连接区均发生RB序列的完全缺失，而共转化拟南芥植株由RB参与的连接区则具有完整的RB序列或其RB仅缺失少数碱基(De Buck et al., 1999)；其次，当LB参与T-DNA连接时，在水稻中LB只发生不等长度的序列缺失或其3’末端1个C碱基发生C→T颠换，不存在与拟南芥转化植株填充DNA (filler DNA) (De Buck et al., 1999; Windels et al., 2003)相似的插入序列。因此，在具有RLLR和LRLR共整合模式的共转化水稻中，其T-DNA连接区因LB序列的不同变化而表现多样性，然而LRRL水稻植株的连接区只表现一种变异，即2个相邻的RB边界完全缺失。此外，伴随着RB或LB边界的完全缺失，其边界内侧序列也缺失1~643 bp不等。根据以上分析，T-DNA边界序列在水稻和拟南芥中表现不同变化，因而产生不同的共整合T-DNA结构。

研究表明，T-DNA共整合形成串联或多拷贝结构的过程与T-DNA整合到植物基因组DNA的重组过程相似，并且相邻T-DNA边界之间填充DNA的产生可能与双链断裂修复(Double-stranded break repair)或其它非特异重组(Illgegitimate recombination)相关，因此，以上过程还需要利用植物细胞的DNA复制或修复系统(De Buck et al., 1999; Windels et al., 2003)。据此可推测，T-DNA边界序列在水稻与拟南芥中表现的功能差异可能来自于两种植物DNA修复因子或复制酶之间的差异，边界序列可能分别以不同方式与水稻和拟南芥的DNA复制或修复系统发生互作。

本研究利用PCR方法还检测到25个由相同T-DNA形成的LRLR多拷贝结构。结果是没能检测到任何LRRL和RLLR连接模式的多拷贝结构，这可能因为LRRL和RLLR多拷贝结构具有完全反向重复的性质，其序列容易形成二级结构，因而妨碍PCR扩增(De Buck et al., 1999)。尽管如此，关于相同T-DNA的LRLR多拷贝结构可以与关于两种T-DNA的LRLR串联结构比较，从而探讨共整合T-DNA结构的形成机理。

研究表明，多拷贝T-DNA可能通过T-DNA复制产生，也可能通过T-DNA连接而形成(Jorgensen et al., 1987; De Buck et al., 2009)。共转化水稻的上述LRLR多拷贝结构和LRLR串联结构的T-DNA连接区具有相似的边界序列变化，例如，多拷贝植株LB序列发生的C→T颠换和碱基缺失等变异均能在LRLR串联植株中找到，只是各自的发生频率具有差异，因此，上述结果为多拷贝T-DNA通过连接产生提供了新的证据。

本研究从少数共转化植株检测到包括T-DNA边界和其内侧序列的大片段缺失(247~643 bp)，其中某些缺失可能会影响相邻GFP或mCherry表达框的完整性，因此少数共转化水稻植株的荧光检测与PCR检测结果不完全一致。此外，转基因结构变异也可能影响荧光蛋白基因的转录或转录后水平调控，从而引起转基因沉默(Depicker et al., 2005)。

本研究采用3个分别含HPT、GFP和mCherry基因的T-DNA载体，通过混和农杆菌方法转化水稻，在愈伤组织阶段开始进行潮霉素抗性、GFP和mCherry荧光的筛选，获得了多个共转化植株和T-DNA共整合结构。双菌株共转化研究主要使用2个T-DNA载体。De Buck等(2009)曾利用7~10个载体类型，将各载体的农杆菌转化菌株混合并共转化拟南芥，但是其中80%的转化植株只含有1种载体的T-DNA，含3~4个T-DNA类型的共转化植株比例低于4%。所以我们认为，通过共转化研究T-DNA整合机理以2~3个载体比较合适。本研究结果和研究方法，为深入解析转基因植物T-DNA整合的分子机理具有重要借鉴意义。

3材料和方法
3.1实验材料
 本研究所用种子材料为粳稻品种日本晴(Oryza sativa L. spp. japonica cv. Nipponbare)。

3.2荧光蛋白基因载体的构建
3.2.1 mCherry载体构建
pLYL04载体的构建采用以下4个DNA片段进行连接：(1) HindⅢ+BglⅡ双酶切pLYL05质粒获得的P35S启动子片段；(2) BglⅡ+NotⅠ双酶切pLYL03质粒获得的mCherry片段；(3) EcoRⅠ+NotⅠ双酶切pHHY01质粒获得的Tnos终止子片段；(4) EcoRⅠ+HindⅢ双酶切pHHY01质粒获得的载体骨架片段。然后将以上4片段连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株。转化菌落分别用mCherry和P35S特异引物进行菌落PCR检测，扩增750 bp的mCherry片段和约800 bp的P35S片段。再随机挑选2个阳性克隆提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切得到预期约2 kb的片段。酶切正确的质粒利用mCherry、P35S以及Tnos的特异引物进行测序验证。

3.2.2 GFP载体构建
用EcoRⅠ+HindⅢ双酶切pLYL08获得P35SGFP-Tnos表达框，用EcoRⅠ+HindⅢ双酶切pHHY01获得载体骨架片段，然后将以上2个DNA片段连接和转化大肠杆菌DH5α菌株。转化菌落分别用GFP和P35S特异引物进行菌落PCR，检测720 bp的GFP片段和800 bp的P35S片段。将阳性克隆用GFP、P35S以及Tnos的特异引物进行测序验证，测序正确的载体命名为pLYL07。

载体构建所使用的中间载体pHHY01、pLYL03、pLYL05、pLYL08以及pCAMBIA1301均为本实验室保存质粒。质粒转化所用的大肠杆菌菌株DH5α购自北京全式金公司，水稻转化所用的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105为本实验室保存菌株。pLYL04、pLYL07以及pCAMBIA1301质粒经电击法转化到EHA105，转化菌株在50%甘油和-80℃保存备用。所用的连接酶、限制性内切酶等均购自宝生物工程有限公司(辽宁大连TaKaRa公司)。

3.3“三菌株”共转化水稻愈伤组织
分别将pLYL04、pLYL07和pCAMBIA1301载体的农杆菌转化菌株接种于10 mL的LB/Kan⁺Str⁺液体培养基，28℃下培养，直至OD值为1.0。按照1:1:1体积比将3种农杆菌培养液混合，混合菌液在4 000 ×g离心力下离心5 min，弃上清，在AAM培养液中重悬浮，如此再次洗涤菌液1次。然后将菌液侵染水稻愈伤组织。3 d后，将共培养的愈伤组织用无菌水洗净，超净台中吹干愈伤表面水分，转移到筛选培养基(各种培养基的配制，参见李亚丽等(2012))进行选择培养。经过两轮约40 d的筛选培养产生潮霉素抗性(HPT⁺)愈伤。然后用BLS灯式荧光检测器筛选带有mCherry红色荧光或者GFP绿色荧光的愈伤组织。红色和绿色荧光阳性的愈伤组织经过分化培养和生根培养，产生共转化水稻植株。再次在BLS灯式荧光检测器下检测水稻转化幼苗的红色和绿色荧光，确认转化阳性植株。

3.4 T₀植株HPT、GUS、mCherry和GFP的PCR鉴定以及T₁幼苗的荧光检测
采用TPS法(Dellaporta et al., 1983)提取T₀代水稻植株的叶组织DNA。利用HPT-F/HPT-R、GUS-F/GUS-R、mCherry-F/mCherry-R以及GFP-F/GFP-R共4对PCR引物(表4)，分别扩增水稻DNA中的HPT、GUS、mCherry和GFP基因。PCR反应体系为2×Taq Master Mix 10 μL、正反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)、模板DNA 1 μL、ddH₂O 8.2 μL，总体积20 μL。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸7 min，16℃保存。

表4 PCR引物的DNA序列 Table 4 DNA sequences of PCR primers

从T₀代植株收获T₁种子，去壳种子用70%的乙醇浸泡15 s，然后用35%的NaClO浸泡20 min，无菌水冲洗4次，在MS培养基上发芽5 d，BLS灯式荧光检测器下观察胚芽与胚乳交接处的荧光信号。

3.5转基因植株T-DNA共整合结构的PCR分析
根据T-DNA载体两端的DNA序列，分别设计特异引物LZL86、LZL87、LZL88、LZL89、LZL90、LZL91 (表4)，并采用不同的引物组合(表5)对mCherry⁺GFP⁺双阳性植株、单荧光植株以及非荧光植株的串联模式进行PCR检测。PCR反应体系为2×Taq Master Mix 15 μL、正反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)、模板DNA 1 μL、ddH₂O 13.2 μL，总体积30 μL。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min，16℃保存。将扩增的片段回收，进行DNA测序验证。

表5 检测共整合T-DNA结构的PCR引物 Table 5 PCR primers for detection of co-integrated T-DNA structures

作者贡献
赵建华是本实验研究的主要执行人；李亚丽完成部分转化载体构建和转基因水稻材料的创制；刘中来完成部分转基因水稻材料的PCR分析；赵建华和瞿绍洪完成论文写作和修改；瞿绍洪为项目构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项课题(2011ZX08010-002-002)、浙江省重点科技创新团队——转基因农作物新品种培育科技创新团队项目(2011R50023)和浙江省农科院学科带头人启动基金共同资助。感谢周洁、李军、何海燕、高晓庆等在研究工作中提供的帮助。

参考文献
Afolabi A.S., Worland B., Snape J.W., and Vain P., 2004, A large-scale study of rice plants transformed with different T-DNAs provides new insights into locus composition and T-DNA linkage configurations, Theor. Appl. Genet., 109(4): 815-826

De Buck S., Jacobs A., Van Montagu V., and Depicker A., 1999, The DNA sequences of T-DNA junctions suggest that complex T-DNA loci are formed by a recombination process resembling T-DNA integration, Plant J., 20(3): 295-304

De Buck S., Podevin N., Nolf J., Jacobs A., and Depicker A., 2009, The T-DNA integration pattern in Arabidopsis transformants is highly determined by the transformed target cell, Plant J., 60(1): 134-145

De Neve M., De Buck S., Jacobs A., Van Montagu V., and Depicker A., 1997, T-DNA integration patterns in co-tra- nsformed plant cells suggest that T-DNA repeats originate from co-integration of separate T-DNAs, Plant J., 11(1): 15-29

Dellaporta S.L., Wood J., and Hicks J.B., 1983, A plant DNA minipreparation: version Ⅱ, Plant Mol. Biol. Rep., 1(4): 19-21

Depicker A., Sanders M., and Meyer P., 2005, Transgene silencing, In: Meyer P. (ed.), Plant Epigenetics, Blackwell Publis- hing Ltd, Oxford, UK, pp.1-32

Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E., Endo S., Yamada K., and Komamine A., 2001, Systems for the removal of a selection marker and their combination with a positive marker, Plant Cell Rep., 20(5): 383-392

Halpin C., 2005, Gene stacking in transgenic plants-the challenge for 21st century plant biotechnology, Plant Biotechnol. J., 3(2): 141-155

Jones J.D.G., Gilbert D.E., Grady K.L., and Jorgensen R.A., 1987, T-DNA structure and gene expression in petunia plants transformed by Agrobacterium tumefaciens C58 derivatives, Mol. Gen. Genet., 207: 478-485

Jorgensen R., Snyder C., and Jones J.D., 1987, T-DNA is organized predominately in inverted repeat structures in plants transformed with Agrobacterium tumefaciens C58 derivatives, Mol. Gen. Genet., 207: 471-477

Komari T., Hiei Y., Saito Y., Mural N., and Kumashiro T., 1996, Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers, Plant J., 10(1): 165-174

Li G.M., Song K., Liu L.X., and Xu S.M., 2004, Studies of co-transformation for the elimination of selective marker genes from transgenic plants, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 2(6): 839-845 (李桂民, 宋凯, 刘立侠, 许守民, 2004, 共转化法删除转基因植物筛选标记基因的研究, 分子植物育种, 2(6): 839-845)

Li Y.L., Liu Z.L., Zhou J., Xu G.J., and Qu S.H., 2012, Genetic analysis of mCherry transgenic rice and molecular characterization of T-DNA integration sites in the rice genome, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 10(2): 121-130 (李亚丽, 刘中来, 周洁, 徐国娟, 瞿绍洪, 2012, 转mCherry基因水稻的遗传分析及T-DNA整合位点的研究, 分子植物育种, 10(2): 121-130)

Windels P., De Buck S., Van Bockstaele E., De Loose M., and Depicker A., 2003, T-DNA integration in Arabidopsis chro- mosomes, presence and origin of filler DNA sequences, Plant Physiol., 133(4): 2061-2068

Wu S., Xiao L.T., Liu Q., Shen G.Z., and Wang R.Z., 2008, Transgenic plants of markerless antisense Waxy indica rice obtained by Agrobacterium-Mediated co-transformation, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 41(10): 2909-2915 (吴顺, 萧浪涛, 刘清, 沈革志, 王若仲, 2008, 共转化获得无抗性标记的转反义蜡质基因籼稻, 中国农业科学, 41(10): 2909-2915)